Egzersiz ve trombosit aktivatörü kalsiyum klorür, trombosit açısından zengin plazmanın (PRP) büyüme faktörü içeriğini etkiler: PRP tedavisini etkileyebilecek gözden kaçan biyokimyasal faktörler

ÖZET
Arka plan
Egzersizin trombosit hemostaz faktörlerini etkilediğine dair güçlü kanıtlar vardır, ancak trombosit açısından zengin plazmadaki (PRP) büyüme faktörü konsantrasyonları üzerindeki bu potansiyel etki hiç çalışılmamıştır. Ayrıca PRP ile birlikte kullanılan aktive edici ajanların etkilerine odaklanan az sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmanın ilk amacı, egzersizin trombosit ve trombosit kaynaklı büyüme faktörleri (PDGF)-AB, hepatosit büyüme faktörü (HGF), insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1) ve vasküler endotel büyüme faktörü ve PRP'de (VEGF) konsantrasyonları üzerindeki etkisini değerlendirmektir. Ayrıca, aktive edici ajan kalsiyum klorürün (CaCl2) farklı egzersiz durumlarıyla ilişkili olarak büyüme faktörü konsantrasyonu üzerindeki etkisini incelemekti. Yöntemler Kontrollü laboratuvar çalışması. On sağlıklı katılımcı, kanın hemen öncesinde, sonrasında ve 18 saat sonra geri çekildiği 1 saatlik maksimum altı egzersiz gerçekleştirdi. PRP, her koşulda hem aktif CaCl2 hem de aktif olmayan formda hazırlandı. PDGF AB, HGF, IGF-1 ve VEGF konsantrasyonları standart ELISA sistemleri kullanılarak değerlendirildi.
Sonuçlar
Egzersizin trombosit konsantrasyonu üzerinde önemli bir etkisi olmadı, ancak hem VEGF hem de PDGF-AB konsantrasyonlarını önemli ölçüde baskıladı. Egzersiz durumunun IGF-1 veya HGF konsantrasyonu üzerinde anlamlı bir etkisi olmamıştır. CaCl2 ile aktivasyon, PDGF-AB ve IGF-1 konsantrasyonlarında önemli bir artışa, değişmemiş VEGF'ye ve önemli ölçüde azalmış HGF konsantrasyonlarına neden oldu. Sonuçlar Egzersiz, önemli ölçüde azaltılmış VEGF ve PDFG-AB konsantrasyonları ile PRP'deki PDGF'leri önemli ölçüde etkiler. Ayrıca, PRP'nin CaCl2 ile aktivasyonu, trombositlerden farklılaştırılmış bir GF salınımı ile sonuçlanır. Bu ilgili faktörler potansiyel olarak günlük klinik uygulamadaki sonucu etkileyebilir ve gelecekteki çalışma tasarımında hesaba katılması önerilir.

​

GİRİŞ
14 kas-iskelet endikasyonu için yaygın olarak kullanılan otolog trombosit açısından zengin plazmanın (PRP) etkinliğine ilişkin yakın tarihli bir meta-analiz, ağırlıklı olarak çalışma protokollerinin standardizasyonundaki eksiklikler ve trombosit uygulamasını etkileyen karıştırıcı faktörler nedeniyle, kullanımıyla ilgili çelişkili kanıtlar göstermiştir. Yazarlar, optimal hazırlık, dozaj, aktive edici ajanların etkileri ve otolog kan ürünlerinin enjekte edilmesinin zamanlamasına odaklanan temel bilim çalışmalarını şiddetle tavsiye etmektedir. Görünen klinik popülaritesine ve giderek artan sayıda klinik çalışmasına rağmen, hücresel ve hücre dışı elementlerin rolü, optimal trombosit konsantrasyonları, lökositler ve salınan büyüme faktörü (GF) dozu, zamanlaması ve aktivasyonu hakkında hala yalnızca sınırlı bir anlayış vardır. Trombosit kaynaklı GF (PDGF), trombositler içinde bulunan a-granüllerinde depolanır ve aktivasyon üzerine seçici bir şekilde salınır. Trombosit aktivasyonu, ligandlara bağlanan spesifik trombosit membran glikoproteinlerine, kinaz aktivasyonuna ve hem yoğun tübüler sistemden hem de hücre dışı ortamdan sitoplazmik kalsiyum akışına bağlıdır ve in vivo olarak trombin, kalsiyum, kollajen ve kayma stresi gibi bir dizi faktör tarafından başlatılabilir. Her trombosit, GF'ye ek olarak adeziv proteinler, kemokinler, fibrinolitik proteinler ve pıhtılaşma önleyici moleküller içeren yaklaşık 80 a-granülü içerir. In vitro, kalsiyum ve trombin, PRP'den GF salınımını indüklemek için rutin olarak kullanılır; klinik uygulamada, PRP'nin ön aktivasyonu yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, enjeksiyon öncesi aktivasyon için terapötik gereklilik konusunda kanıt ve fikir birliği yoktur. Trombositlerin α-granüllerinden salınan GF'nin, PRP'nin rejeneratif faydalarını sağladığı varsayılmaktadır. Hematolojik çalışmalar, egzersizin, egzersizi takiben trombosit kaynaklı prokoagülan mikropartiküllerin salınımını artırarak trombosit fonksiyonunu etkileyebileceğini göstermiştir. Sonuç olarak, egzersizin trombositlerden GF salınımını da etkilemesi ve böylece PRP'nin klinik etkinliğini etkilemesi mümkündür. Bu çalışmanın ilk amacı, PRP'de egzersizin trombosit ve PDGF'ler PDGF-AB hepatosit büyüme faktörü (HGF), insülin benzeri büyüme faktörü-1 (IGF-1) ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) konsantrasyonları üzerindeki etkisini değerlendirmektir. . İkinci amaç, aktive edici ajan kalsiyum klorürün (CaCl2) farklı egzersiz durumlarıyla ilişkili olarak GF konsantrasyonu üzerindeki etkisini incelemekti.

​

METODOLOJİ
Katılımcılar
Çalışmaya katılımın tüm riskleri ve faydaları kapsamlı bir şekilde açıklandıktan sonra on bir beyaz erkek hasta çalışmaya alındı. Hastalar daha sonra, herhangi bir yaralanma türünden mustarip olmaları veya trombosit fonksiyonunu etkileyebilecek herhangi bir ilaç almaları durumunda analizden çıkarıldı. Çalışma protokolü Kurumsal Tıbbi Etik Kurulumuz tarafından onaylandı. Tüm hastalar yazılı bilgilendirilmiş onam verdi.

​

Deneysel genel bakış
Her katılımcıdan 36 saat egzersiz yapmadığını ve 12 saat aç kaldıktan sonra (su hariç) egzersiz laboratuvarına rapor vermesi istendi. Kontrollü çevre laboratuvarına vardıklarında (~21°C, %40–60 Bağıl Nem, 760–770 mm Hg), vücut kütlesi ve spora katılım kaydedildi. İstirahat kan basıncı ölçüldü ve bir antekubital venden venöz kan (10 mi) alındı. Katılımcılar daha sonra maksimum aerobik kapasiteyi ve tepe güç çıkışını (PPO) tahmin etmek için elektronik olarak frenlenmiş bir bisiklet ergometresinde (Lode Excalibur Sport, Groningen, Hollanda) değiştirilmiş26 maksimum altı bisiklet testi yaptılar. Tek bir araştırmacı tüm bisiklet testlerini denetledi. 7 gün sonra, ilk laboratuvar prosedürü, aynı açlık ve egzersizden kaçınma protokolü ile tekrarlandı. Egzersizden önce katılımcılardan 54 ml kan alındı ve bu kan hemen aşağıda açıklandığı gibi hazırlandı. Katılımcılardan daha sonra tahmini PPO'larının (önceki teste dayalı olarak) %50'sinde 1 saat egzersiz yapmaları istendi. Egzersizin kesilmesinden hemen sonra 54 ml daha kan örneği alındı. Katılımcılara egzersizden kaçınmaları tavsiye edildi; Egzersiz nöbetinden 18 saat sonra, her denekten analiz için 54 ml daha kan alındı.

​

Hematolojik analiz
Tam kan trombosit sayımının hemen analizi için EDTA kaplı bir tüpe çekilen 10 ml ile antekubital venden kan örneği alındı. Tüm trombosit analizleri, CELL DYN 3700 SL analiz cihazı (Coulter Count; Abbot Diagnostics, Chicago, ABD) kullanılarak tamamlandı. PRP, GPS III santrifüj ayırma sisteminden (Biomet Recover, GPS III Platelet Separation System) üreticinin talimatları kullanılarak hazırlandı. 60 ml'lik bir şırıngada, 6 ml ACD-A antikoagülana 54 ml tam kan ilave edildi ve hemen 3200 rpm'de 15 dakika santrifüjlendi. PRP ve trombositten fakir plazmanın (PPP) ekstraksiyonu, ticari olarak temin edilebilen ayırma sisteminde belirtilen yönteme göre tamamlandı. PRP ve PPP hacimleri kaydedildi ve her numune, yukarıda gösterildiği gibi trombosit konsantrasyonu (PC) analizi için kullanılan bir kısım ile 500 ul'lik parçalara ayrıldı. Kalan numuneler ya hemen -80°C'de saklandı ya da 37°C'de 1 saat CaCl2 (25 mM) ile aktivasyona tabi tutuldu. Aktivasyonun ardından örnekler 4000 rpm'de 4°C'de 10 dakika santrifüjlendi ve fibrin pıhtısı süpernatandan ayrıldı. Süpernatan kısımlara ayrıldı ve analize kadar -80°C'de donduruldu. PRP'deki PDGF-AB, HGF, IGF-1 ve VEGF'nin hem aktif olmayan hem de in vitro aktivasyonu takiben GF seviyeleri ticari olarak temin edilebilen ELISA (R&D systems, Oxon, UK) ile değerlendirildi. Tüm inter- ve intra-assay varyasyon katsayıları <%10 idi.

İstatistiksel analiz
Tüm istatistiksel analizler SPSS (V.19.0) kullanılarak yapıldı. Veriler, aykırı değerler ve normallikten sapma için tarandı ve bu nedenle herhangi bir dönüşüm uygulanmadı. Ek olarak, sırasıyla PPP ve PRP'deki farklı GF'ler (HGF, IGF, PDGF-AB ve VEGF), aktivasyon durumu (aktif veya aktif değil) ve zaman grubu (0 saat) için sabit etki terimlerini içeren bir lineer karma model kullanılarak analiz edildi. (dinlenme), egzersizden hemen sonra ve egzersizden 18 saat sonra) ve katılımcılar ve artıklar için rastgele etki terimleri. Etki büyüklüğü (ES) kısmi η2 olarak hesaplanmıştır. 0.01, 0.06 ve 0.14'lük ES, sırasıyla küçük, orta ve büyük ilişkiyi gösterir. Anlamlı bir etkinin bulunduğu durumlarda, post hoc ikili karşılaştırmalar yapıldı. İstatistiksel anlamlılık p<0.05 olarak kabul edildi.

SONUÇLAR
Bir katılımcı aynı anda trombosit baskılayıcı bir ilaç (klopidogrel) kullandığı için çalışmadan çıkarıldı ve ardından 10 katılımcının (ortalama yaş 34,3 ±3,2 yıl; ortalama vücut kitle indeksi 26,1±4,28 kg/m2) verileri analiz edildi. Tüm katılımcılar fiziksel olarak formdaydı ve düzenli olarak orta ila yoğun fiziksel egzersiz yaptı. Tam kandaki ortalama PC, beklenen aralıklarda (271,9 ±54,0×103 ml), PRP'de (1065,3 ±4144,8×103 ml) önemli ölçüde arttı ve PPP'de (43,2 ±16,3×103 ml) önemli ölçüde azaldı. Ortalama beyaz kan hücresi konsantrasyonu (WBC), PRP'de (34,06±11,06 × 103 ml) başlangıç tam kan seviyelerinden (7,34 ±1,72×103 ml) önemli ölçüde arttı ve PPP'de (0,04±0,04 × 103 ml) önemli ölçüde azaldı. PRP'de PC, HGF, VEGF veya IGF-1 konsantrasyonları ile ilişkili değildi. PC, PDGF-AB ile pozitif ilişkiliydi (p<0.001); PC'deki her bir birimlik artış, PDGF ile 25.2 birimlik bir artışla ilişkilidir.
Egzersiz durumunun PRP'ye etkisi
PRP PC'de dinlenmeden egzersiz sonrası koşullara önemli bir değişiklik olmadı (Şekil 1). Analiz, egzersiz durumunun PDGF-AB (F (2,41,9)=4,0; p=0,025; ES=0,311) ve VEGF (F (2,42,3)=3,7; p=0,034; ES=0,456), hem VEGF (dinlenme vs 1 h p=0,024; ve vs 18 h p=0,001) hem de PDGF-AB (dinlenme vs 1 h p=0,021; ve vs 18 h p=0,003) konsantrasyonunda önemli baskılama ile (şekil 2) .